賽默飛QuantStudio 5實時熒光定量PCR儀的正確操作使用方法指南。它將分為實驗準備、上機操作、運行監控和后續處理幾個部分，并包含重要的注意事項。

一、賽默飛QuantStudio5實時熒光定量PCR重要部分：實驗準備

1、儀器準備：

（1）開啟電腦和QuantStudio 5儀器電源，等待系統啟動完成。

（2）打開 QuantStudio Design and Analysis 軟件。

（3）檢查儀器狀態，確保無錯誤報警。

2、實驗設計：

在軟件中或紙上規劃好實驗布局，包括：

（1）實驗類型： 標準曲線定量、相對定量（ΔΔCt）、基因分型等。

（2）樣品位置： 明確標準品、待測樣品、陰性對照（NTC）、陽性對照（PC）在板子上的位置。

（3）探針/染料設置： 確定每個孔使用的熒光染料通道（如FAM, VIC, ROX參比染料等）。

3、反應體系配制（在試劑準備區進行）：

（1）根據試劑盒說明書或優化后的方案，計算并配制主混合液。

（2）通常包括：SYBR Green qPCR預混液（或TaqMan探針預混液）、正反向引物、探針（如果使用）、無酶水。

（3）將主混合液分裝到PCR板或八連管中。

注意： 整個過程在冰上操作，避免酶失活。

二、賽默飛QuantStudio5實時熒光定量PCR第二部分：上機運行

1、放置樣品板：

（1）打開QuantStudio 5的樣品槽門。

（2）注意板子方向： 將板子帶有A1角標（左上角）的一側對準樣品槽的對應角落，平穩放入。

（3）輕輕關上樣品槽門。

2、創建并設置新實驗：

（1）在軟件主界面點擊 "New" 或 "創建新實驗"。

（2）選擇實驗類型： 如 Quantitation (定量) -> Standard Curve (標準曲線) 或 Quantitation - Comparative Ct (ΔΔCt)。

（3）選擇板子類型： 如96-well, 0.1 mL。

3、設置實驗參數：

（1）指定樣品： 在軟件界面的虛擬板圖上，用鼠標選擇孔位，然后右鍵或從側邊欄設置其類型（Unknown, Standard, NTC等）和樣品名稱。

（2）指定探針/染料： 為每個孔分配檢測通道。例如，在 Detector 或 Assay 欄選擇或創建對應的染料（如FAM-SYBR）。

（3）設置參比染料： 通常選擇ROX作為參比染料，用于校正孔間差異。

4、編輯反應程序：

點擊 Protocol 選項卡，輸入以下典型的qPCR三步法程序：

（1）階段1：UNG酶消化（可選，防污染）

50°C，2分鐘

（2）階段2：熱啟動/預變性

95°C，2-10分鐘（根據預混液說明書）

（3）階段3：PCR循環（40-45個循環）

變性： 95°C，15秒

退火/延伸： 60°C，1分鐘 （在此步驟采集熒光信號）

（4）對于SYBR Green法，通常在退火/延伸結束時采集信號；對于TaqMan探針法，確保設置正確。

5、啟動運行：

（1）檢查所有參數設置無誤后，點擊 "Start Run"。

（2）軟件會提示你輸入實驗名稱、保存路徑等信息。

（3）確認后，儀器將開始運行。你可以聽到風扇啟動和溫控模塊開始工作的聲音。

三、第三部分：運行監控與數據分析

1、實時監控：

（1）在運行過程中，軟件會實時顯示擴增曲線、熒光信號圖等。

（2）檢查陰性對照（NTC）是否有擴增，陽性對照和標準品曲線是否正常。

2、運行結束：

（1）程序運行完畢后，儀器會發出提示音。

（2）軟件會自動保存數據。

3、數據分析：

（1）在Analysis界面，軟件會根據你選擇的實驗類型自動計算Ct值。

（2）對于標準曲線： 檢查標準曲線的斜率和R2值（理想斜率：-3.3， R2 > 0.99）。

（3）對于熔解曲線（SYBR Green）： 檢查產物特異性，單一峰表明擴增特異。

（4）設置基線（Baseline）和閾值（Threshold），確保它們設置在擴增曲線的指數增長期。

（5）導出數據結果進行進一步分析。

四、第四部分：運行后處理

1、取出樣品板：

（1）待儀器溫度降至安全范圍后（通常為4°C或室溫），打開樣品槽門，取出樣品板。

（2）注意： 板子和樣品可能含有擴增產物，是潛在的污染源。請按照生物危害廢棄物處理規定進行處理。

2、關機：

（1）通常情況下，儀器無需關閉電源，保持待機狀態即可。如果長期不用，可關閉儀器和電腦電源。

（2）填寫儀器使用記錄。

五、常見問題排查

1、信號弱或無信號： 檢查試劑是否失效、探針/引物設計是否合理、模板濃度是否過低、程序設置是否正確（特別是信號采集步驟）。

2、擴增曲線異常： 檢查是否存在抑制劑、模板降解或加樣錯誤。

3、NTC出現擴增： 表明存在污染，需檢查試劑、水、耗材或操作環境。

4、ROX信號報警： 檢查是否在實驗中設置了ROX參比染料，但使用的預混液不含ROX，或反之。